KO first小鼠模型構(gòu)建

一、KO-first 載體設(shè)計原理

KO-first載體通過精巧的基因陷阱（Gene Trap）和條件性模塊設(shè)計，實現(xiàn)"三位一體"功能：

野生型基因

KO-first等位基因

傳統(tǒng)KO

條件性KO

報告基因過表達(dá)

核心元件：

1. 5'同源臂（1.5-3 kb）

2. SA-βgeo-pA（剪接受體-β半乳糖苷酶/新mei素抗性融合基因）

3. floxed 關(guān)鍵外顯子（通常第2-4號外顯子）

4. 3'同源臂（1.5-3 kb）

5. FRT-flanked NeoR（用于陽性篩選，后續(xù)可切除）

二、KO first小鼠模型構(gòu)建流程（以ES細(xì)胞同源重組為例）

1. 靶向載體構(gòu)建

• 設(shè)計要點：

• 關(guān)鍵外顯子兩側(cè)插入loxP位點（間距通常1-2 kb）

• 在5'UTR插入SA-βgeo實現(xiàn)基因陷阱（組成型KO）

• NeoR兩側(cè)加入FRT位點便于后續(xù)Flp刪除

改造

野生型基因: Exon1-Exon2-Exon3

KO-first等位基因: SA-βgeo-loxP-Exon2-loxP-FRT-NeoR-FRT

2. ES細(xì)胞打靶

• 電轉(zhuǎn)與篩選：

• 線性化載體電轉(zhuǎn)至JM8A3.N1等ES細(xì)胞

• G418（NeoR）陽性篩選7-10天

• 克隆驗證：

• 5'端PCR：F1（同源臂外側(cè)） + R1（βgeo內(nèi)）

• 3'端PCR：F2（NeoR內(nèi)） + R2（同源臂外側(cè)）

• Southern blot確認(rèn)單拷貝整合

3. 獲得嵌合體小鼠

• 囊胚注射：將陽性ES細(xì)胞注入C57BL/6N囊胚

• 嵌合體鑒定：毛色嵌合（129Sv ES細(xì)胞→B6背景）

4. 傳代與品系建立

• 第一步交配：嵌合體（公鼠）× WT（母鼠）

• 獲得F1代（SA-βgeo-loxP-Exon2-loxP，NeoR+）

• 第二步交配：F1 × Flp deleter小鼠（刪除NeoR）

• 獲得"clean" KO-first小鼠（僅保留SA-βgeo和loxP）

三、三種應(yīng)用模式切換

1. 傳統(tǒng)KO（組成型敲除）

• 機制：SA-βgeo阻斷基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致功能wan全喪失

• 驗證方法：

• β-gal染色（報告基因表達(dá)）

• Western blot檢測目標(biāo)蛋白缺失

2. 條件性KO（組織特異性敲除）

• 交配策略：

× Cre

KO-first

cKO

• 關(guān)鍵點：

• Cre介導(dǎo)的loxP重組刪除floxed外顯子

• 需驗證目標(biāo)組織中的敲除效率（qPCR/免疫組化）

3. 報告基因過表達(dá)

• 利用SA-βgeo：

• β-gal活性反映內(nèi)源基因表達(dá)模式

• 可用于細(xì)胞譜系追蹤

4. 恢復(fù)野生型（可選）

• 與Flp deleter小鼠交配可刪除SA-βgeo，恢復(fù)野生型等位基因

四、技術(shù)優(yōu)勢與局限性

五、關(guān)鍵優(yōu)化策略

1. 外顯子選擇：

• 優(yōu)先選擇編碼關(guān)鍵功能域的外顯子

• 確保刪除后引起移碼突變（如外顯子2/3）

2. 減少背景干擾：

• 使用自我刪除型NeoR（如neo-DTA）

• 選擇高重組效率ES細(xì)胞系（如JM8A3.N1）

3. 表型分析對照：

• 必須包括：WT、KO-first純合子、KO-first × Cre

六、經(jīng)典應(yīng)用案例

• Tsc1 KO-first模型：

• 傳統(tǒng)KO：胚胎致死（研究發(fā)育功能）

• Nestin-Cre cKO：神經(jīng)發(fā)育缺陷

• β-gal報告基因：揭示Tsc1在腦區(qū)的表達(dá)模式

• p53 KO-first模型：

• 傳統(tǒng)KO：自發(fā)腫瘤表型

• K14-Cre cKO：研究皮膚特異性腫瘤發(fā)生